L-色氨酸中EBT杂质欧洲药典翻译

欧洲药典：L-色氨酸中EBT杂质(1,1’-乙叉双（L-色氨酸）)和其他相关物质 用液相色谱法检查（2.2.29）

缓冲液pH 2.3 取3.90 g NaH2PO4 R溶解于1000 ml水R中，加入700 ml左右2.9 g/L H3PO4 R溶液，用相同的酸溶液调节pH至2.3。

使用前制备样品

标准溶液 取10 .0 mg N-乙酰色氨酸R溶于乙腈R-水R（体积比为10：90）混合溶液中，用相同溶液定容至100.0 ml，取上述溶液2.0 ml，用相同的溶剂再稀释至100.0 ml。

检测溶液（a） 取本品0.10 g溶于乙腈R-水R（体积比为10：90）混合溶液中，用相同的混合溶液稀释至10.0 ml。

检测溶液（b）取本品0.10 g溶于标准溶液，并用相同溶剂稀释至10.0 ml。

参照溶液（a）取1.0 mg EBT（1,1’-乙叉双（L-色氨酸））CRS溶于乙腈R-水R（体积比为10：90）混合溶液中，用相同的溶液定容至100.0 ml。

参照溶液（b）取10.0 ml参照溶液（a），用标准溶液稀释至50.0 ml。

参考溶液（c）取10.0 ml参照溶液（a），用乙腈R-水R（体积比为10：90）混合溶液中稀释至50.0 ml。

参照溶液（d）取本品0.10 g溶于参照溶液（c），并用相同溶液稀释至10.0 ml。

参照溶液（e）取1.0 ml参照溶液（c）于乙腈R-水R（体积比为10：90）混合溶液中，定容至10.0 ml。

HPLC操作过程需遵循：

色谱柱为长0.25 m，内径4.6 mm无菌钢柱，填充物为十八烷基硅烷键合硅胶R（5 μm）

流动相的流速为0.7 ml/min

流动相A：乙腈R：pH 2.3缓冲液＝115：385（体积比）

流动相B：乙腈R：pH 2.3缓冲液＝350：650（体积比）

梯度过程采用如下条件：时间（min）流动相A（V/V百分比）流动相B（V/V百分比）备注0-10

10-45

45-65

65-66

66-80100

100→0

0

0→100

1000

0→100

100

100→0

0等度

线性梯度

等度

线性梯度

再平衡分光光度计检测器波长设为220 nm，保持柱温40 ℃恒定。

注射20 μl参照溶液（b），20 μl参照溶液（d）和20 μl参照溶液（e）。

按上述条件所得的色谱图，保留时间约为8 min的为色氨酸，29 min左右为N-乙酰色氨酸，34 min为EBT（1,1’-乙叉双（L-色氨酸））。调节体系的灵敏度使得用参照溶液（b）所得图谱中N-乙酰色氨酸峰高度至少为整个数值范围的50％。

检测必须满足以下条件，否则无效：

用参照溶液（b）所得的色谱图，N-乙酰色氨酸和EBT（1,1’-乙叉双（L-色氨酸））的分离度至少为8.0。如果可能，调节洗脱梯度的时间过程。增加流动相A洗脱的时间可延长保留时间和提高分离度。

用参照溶液（e）所得的色谱图信噪比至少为15。

注射20 μl检测溶液（a）和20 μl检测溶液（b）。检查用检测溶液（a）所得色谱图中，没有保留时间为N-乙酰色氨酸的峰（在这种情况下，调整N-乙酰色氨酸峰的面积）。用检测溶液（b）所得色谱图中，和EBT相关的任何峰的面积不能大于用参照溶液（e）（10 ppm）所得图谱主峰面积的0.5倍；出峰位置在色氨酸前的所有物质峰面积的总和不能大于由参照溶液（b）（100 ppm）所得图谱中对应N-乙酰色氨酸的峰面积的0.6倍；出峰位置在色氨酸后一直到N-乙酰色氨酸保留时间的1.8倍之间，除N-乙酰色氨酸外的所有物质峰面积的总和不能高于由参照溶液（b）（300 ppm）所得图谱中N-乙酰色氨酸峰面积的1.9倍。峰面积小于由参照溶液（b）所得图谱中N-乙酰色氨酸峰面积0.02倍的所有物质均可忽略。

欧洲药典色氨酸中中EBT杂质检测方法：

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